Régulation du pH granulaire et cytosolique dans les cellules β : mécanismes et rôle dans l'amplification de la sécrétion d'insuline par le glucose
(2007)
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- Henquin, Jean-Claude
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- Contexte: Le glucose contrôle la sécrétion d'insuline par les cellules b grâce à deux voies de signalisation. La voie déclenchante comporte les étapes suivantes: le métabolisme du glucose augmente le rapport ATP/ADP ce qui conduit à la fermeture des canaux K+-ATP dépendants et entraîne une dépolarisation de la membrane plasmique, l'ouverture des canaux Ca2+-voltage dépendants et l'entrée de Ca2+ dans la cellule. L'augmentation de la [Ca2+]c qui en résulte suffit pour déclencher la sécrétion d'insuline. La voie amplificatrice, au contraire, n'implique pas d'élévation supplémentaire de la [Ca2+]c mais augmente l'efficacité du Ca2+ sur l'exocytose. Ses mécanismes sont encore mal connus et ont fait l'objet de mon travail de thèse. L'amplification de la sécrétion d'insuline est classiquement détectée par une approche pharmacologique qui supprime tout effet du glucose sur les canaux KATP. Dans ma première étude, j'ai vérifié qu'elle intervient également dans des conditions physiologiques de stimulation par le glucose seul et déterminé sa contribution à chacune des deux phases de sécrétion (pic transitoire de la première phase et plateau soutenu de la seconde). Dans ma deuxième étude, j'ai analysé l'effet du glucose sur le pH des granules d'insuline et déterminé si ces modifications de pH granulaire interviennent dans la voie amplificatrice. Dans ma troisième étude, j'ai évalué le rôle de l'isoforme NHE1 de la famille des échangeurs Na+/H+ dans le contrôle du pH cytosolique des cellules b et évalué l'impact des changements de pHc pour l'amplification. Méthodes: Les îlots de souris ont été obtenus par digestion à la collagénase du pancréas. Après culture durant une nuit, ils ont été périfusés dans un milieu tamponné par du HCO3- ou de l'HEPES et les changements de [Ca2+]c, pHg, pHc, NAD(P)H et sécrétion d'insuline ont été mesurés. Des PCR en temps réel ont été réalisées sur des îlots de souris C57Bl6 contrôles et mutantes pour NHE1.<BR> Résultats: Dans la première étude, les changements de la [Ca2+]c et de la sécrétion d'insuline d'îlots de souris stimulés par différentes concentrations de glucose ont été mesurés en parallèle. Alors que la corrélation temporelle (cinétique biphasique) est excellente, la corrélation quantitative entre le signal déclenchant et la sécrétion d'insuline est imparfaite, aussi bien durant la première que la seconde phase de sécrétion: le signal déclenchant est maximal à des concentrations de glucose n'induisant qu'une sécrétion d'insuline semi-maximale. Mes observations établissent l'existence de la voie amplificatrice dans des conditions physiologiques (sans utilisation d'agents pharmacologiques) et démontrent sa contribution aux deux phases de sécrétion. Dans la deuxième étude, j'ai montré que le glucose acidifie les granules d'insuline par un mécanisme qui requiert son métabolisme, qui est indépendant des modifications de la [Ca2+]c et de la sécrétion d'insuline mais qui fait intervenir les ions Cl-. Utilisant la concanamycine, un inhibiteur de la pompe à protons des granules, la méthylamine, une base alcalinisant les granules, ou un milieu sans chlorure, j'ai démontré que l'acidification aiguë induite par le glucose n'est pas responsable de l'amplification, mais qu'un pH granulaire acide est indispensable à la sécrétion d'insuline. Dans la troisième étude, j'ai montré par PCR en temps réel que NHE1 est l'isoforme plasmique majeure de l'échangeur Na+/H+ dans les îlots de souris. En utilisant des souris mutantes pour NHE1, j'ai montré que l'alcalinisation du cytosol produite par le glucose n'est pas due à cet échangeur mais au transporteur HCO3-. Ces souris m'ont également permis d'établir que les inhibiteurs des échangeurs Na+/H+ de la famille du diméthylamiloride augmentent la sécrétion d'insuline par un mécanisme indépendant de l'échangeur et du pHc. Finalement, j'ai montré que ni l'alcalinisation ni l'acidification du cytosol produite par le glucose, respectivement dans un milieu avec et sans HCO3-, n'a d'impact sur la sécrétion d'insuline et plus particulièrement sur la voie amplificatrice. <BR> Conclusions: L'amplification de la sécrétion d'insuline par le glucose est opérationnelle en conditions physiologiques, aussi bien durant la première que la seconde phase de sécrétion. Cette amplification ne fait intervenir ni des modifications de pH granulaire, ni des modifications de pH cytosolique.
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Citations
Stiernet, P. (2007). Régulation du pH granulaire et cytosolique dans les cellules β : mécanismes et rôle dans l’amplification de la sécrétion d’insuline par le glucose. https://hdl.handle.net/2078.5/112077