A system for detection and identification of foodborne pathogenic bacteria based on a “Combinatory qPCR” technology
(2014)
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- (fr) Les épidémies d'origine alimentaire sont une problématique importante à travers le monde. Deux agents pathogènes alimentaires parmi les plus importants sont Salmonella spp. et Listeria monocytogenes. Les méthodes de référence pour détecter ces bactéries sont des procédures internationales normalisées : méthodes ISO, qui sont reconnues dans le monde entier. Ces méthodes sont essentiellement basées sur des méthodes de culture longues (plusieurs jours) et assez laborieuses. Afin d'identifier rapidement la source des épidémies d'origine alimentaire, de mieux gérer les crises liées à l'alimentation et de permettre une libération rapide des lots autocontrôlés par les industriels du secteur alimentaire, des outils rapides et fiables pour la détection et l'identification des agents pathogènes dans les denrées alimentaires ont été développés. Les méthodes alternatives les plus prometteuses sont basées sur la PCR ou PCR en temps réel (qPCR). Cependant, plusieurs inconvénients majeurs demeurent: i) les systèmes de détection qPCR déjà développés ne ciblent, en général, qu’un agent pathogène (mono-genre) et ne permettent donc pas d’en détecter plusieurs simultanément; ii) ces systèmes de détection n’utilisent en général qu’une seule paire d’amorces (mono-cible) et ceci peut potentiellement conduire à des faux-négatifs quand la séquence cible est mutée ou délétée ; iii) ces différents systèmes de détection ne sont pas harmonisés et utilisent différentes technologies (par exemple TaqMan® ou SYBR®Green) et des programmes PCR différents. Ils ne peuvent donc pas être utilisés ensemble dans un système multi-cibles et iv) aucune directive officielle, comprenant des critères spécifiques d’acceptation, n’est disponible pour valider des analyses qPCR pour la microbiologie alimentaire. Le projet CoSYPS Path Food tend à remédier à ces inconvénients en développant et validant un système multi-genres, multi-cibles et multi-niveaux pour la détection simultanée dans les matrices alimentaires, des Salmonella spp. et des Listeria spp. vivantes. Le système développé dans ce projet s’appelle le système de détection CoSYPS Path Food pour “Combinatory SYBR®Green qPCR Screening system for pathogens detection in food samples”. Il consiste en 11 tests qPCR pour la détection des genres Salmonella et Listeria et leur discrimination au niveau du genre, de l’espèce et de la sous-espèce. Chaque niveau de discrimination (genre, espèce et sous-espèce) est constitué d'au moins deux cibles afin d’augmenter la probabilité de détecter des souches atypiques qui auraient une délétion ou une mutation dans une des cibles. Ce système multi-cibles réduit donc la probabilité de faux-négatifs par rapport aux systèmes (q)PCR mono-cibles actuels. Tous les tests qPCR développés pour le système de détection CoSYPS Path Food ont été conçus pour être exécutés simultanément sur la même plaque et ont tous été validés sur la base de deux directives existantes: une pour la validation des tests de PCR en microbiologie alimentaire (ISO 22118:2011) et l'autre pour la validation des analyses qPCR pour la détection des OGM, domaine dans lequel la qPCR est la méthode de détection de référence (lignes directrices ENGL). Pour faciliter l’analyse et l’interprétation des résultats, un outil informatique de soutien a été développé. Cet outil contient toutes les informations sur les 11 tests qPCR (séquences des amorces, concentrations de chaque amorce…) ainsi qu’un calcul automatique des mixes PCR pour chaque test et un système support de décision (SSD) afin d’obtenir une analyse uniforme des résultats. Cette interprétation automatique des résultats de la qPCR garantit d’obtenir la même conclusion quel que soit l’analyste. Ensuite, afin d’appliquer ce système sur des matrices alimentaires qui peuvent contenir des bactéries mortes ou vivantes, une étude sur la discrimination de bactéries mortes et vivantes à l'aide de la « viability-qPCR » a été effectuée. Cette étude a montré les limites de la « viability-qPCR » et a permis de conclure qu’une étape d’enrichissement avant la qPCR était préférable à l’utilisation de la « viability-qPCR ». Au regard de ces résultats, la méthode complète CoSYPS Path Food a pu être développée. Elle comprend toutes les étapes de l’enrichissement de l'échantillon alimentaire jusqu’à l'isolement et la confirmation de la souche et a ensuite été validée, sur des prélèvements externes (éponge) de carcasse de bœuf. Ce type d’échantillon a été choisi comme modèle parce que la viande est une des sources les plus importantes de toxi-infection alimentaire et l’éponge de carcasse de bœuf, qui est un échantillonnage de la surface, est reconnue comme étant la technique d’échantillonnage la plus appropriée pour le contrôle microbiologique de la viande dans les abattoirs. La méthode complète CoSYPS Path Food a donc été validée sur ces éponges de carcasse de bœuf artificiellement contaminées avec un ou deux pathogènes alimentaires : Salmonella et Listeria, à différentes concentrations. La validation a été effectuée en comparant, selon la norme ISO 16140:2003, les résultats obtenus avec la méthode complète CoSYPS Path Food et ceux obtenus avec les méthodes conventionnelles de culture. Pour conclure, grâce à sa stratégie multi-cibles, le système CoSYPS Path Food est un système fiable car un nombre inférieur de faux-négatifs est attendu par rapport aux systèmes de détection qPCR mono-cible. En outre, grâce à sa stratégie multi-niveaux, le système CoSYPS Path Food donne des informations supplémentaires sur les souches détectées (espèces, sous-espèces), qui peuvent orienter l’isolement et faciliter la récupération de la souche détectée dans l’échantillon. La méthode complète CoSYPS Path Food est aussi une alternative rapide aux méthodes conventionnelles basées sur la culture puisque les souches cibles sont détectées en deux jours alors que quatre à cinq jours sont nécessaires avec les méthodes classiques de culture. En outre, la méthode complète CoSYPS Path Food est aussi efficace que les méthodes conventionnelles puisque leurs limites de détection sont les mêmes, c'est-à-dire 4 à 16 UFC Listeria/éponge et de 2 à 11 UFC Salmonella/éponge, même si les deux pathogènes sont présents en même temps dans des échantillons contenant beaucoup de microflore annexe. Par ailleurs, la méthode complète CoSYPS Path Food est modulaire et peut être adaptée à différentes matrices alimentaires et/ou d’autres pathogènes. La méthode complète CoSYPS Path Food est donc une bonne alternative aux méthodes de culture conventionnelles de détection des bactéries pathogènes dans l’alimentation.
- Affiliations
Citations
Piednoir, E. (2014). A system for detection and identification of foodborne pathogenic bacteria based on a “Combinatory qPCR” technology. https://hdl.handle.net/2078.5/55373