Analyse du rôle des glycosomes dans l'adaptation de Trypanosoma brucei aux changements environnementaux
(2008)
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- Michels, Paul
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- Le parasite responsable de la maladie du sommeil, Trypanosoma brucei, a un cycle de vie complexe comprenant de nombreuses formes, chacune adaptée à l'environnement de l'hôte mammifère ou insecte du point de vue morphologique et métabolique. Au cours de ces étapes de différenciation, l'importance relative de la glycolyse et des processus mitochondriaux varie. La forme sanguicole dépend entièrement de la glycolyse pour la production d'ATP et son métabolisme mitochondrial est presque totalement réprimé, alors que pour le trypanosome procyclique trouvé chez l'insecte, la glycolyse est nettement moins importante. Chez les trypanosomatidés et tous les autres protozoaires de l'ordre de Kinetoplastida, la majorité des enzymes glycolytiques sont séquestrées dans des organites spécifiques appelés glycosomes. Ils sont apparentés aux peroxysomes de levure, de par leur morphologie, leur biogenèse et la présence de certains systèmes enzymatiques communs. Chez différentes espèces de levure, comme chez les trypanosomes, le métabolisme et la composition enzymatique des peroxysomes dépendent des conditions de croissance. Chez ces organismes, la biogenèse et la dégradation des organites se déroulent de façon sélective et régulée. La population des peroxysomes est hétérogène ; les vieux organites redondants ou plus adaptés à l'environnement sont dégradés par pexophagie, un processus similaire à celui de l'autophagie, alors que de nouveaux peroxysomes, contenant un répertoire métabolique différent, sont synthétisés. Par conséquent, ce système particulier de compartimentation augmente la flexibilité métabolique de la cellule et donc la capacité à s'adapter rapidement aux changements environnementaux. L'objectif du projet présenté dans cette thèse consistait à déterminer si la situation était similaire chez le trypanosome en étudiant le renouvellement des glycosomes et des enzymes glycosomales chez T. brucei au cours de sa différenciation. Dans un premier temps, nous avons testé si la dégradation des glycosomes se produisait lorsque les parasites se différenciaient d'une forme à l'autre du cycle cellulaire, et ce en étudiant la morphologie grâce aux techniques de microscopie confocale et électronique. Pendant la transition entre les différentes formes sanguicoles, une légère mais significative augmentation de la co-localisation entre les glycosomes, marqués immunologiquement par l'enzyme marqueur aldolase, et les lysosomes, marqués par la protéine p67, a été remarquée, indiquant une augmentation de la dégradation des glycosomes. La tendance était encore plus importante lors de la transition de la forme sanguicole à procyclique. De plus, nous avons pu montrer qu'en l'absence de nutriments, les parasites induisaient aussi la dégradation des organites. Le processus de dégradation des glycosomes activé lors de la différenciation des trypanosomes ou en situation de famine vis-à-vis d'une source d'énergie était similaire à l'autophagie des peroxysomes de levure et l'augmentation de la taille du lysosome suggérait que cela se produisait par micropexophagie. Ensuite, les variations du métabolisme pendant le processus de différenciation ont été analysées en suivant l'expression d'enzymes choisies, par Western blot semi quantitatif et PCR quantitative. En effet, des changements dans les niveaux de protéines marqueurs de différents compartiments du parasite comme les glycosomes, la mitochondrie ou le cytosol ont été observés. Notamment, les enzymes spécifiques des formes sanguicoles étaient rapidement remplacées par celles typiques des formes procycliques ; les résultats sont compatibles avec une augmentation du renouvellement des glycosomes. Par contre, les niveaux d'ARN correspondant à ces protéines ne présentaient pas de variations importantes. Ensemble, ces résultats indiquent que l'expression des enzymes métaboliques est régulée en fonction de l'étape du cycle de vie du parasite et, en accord avec de nombreux autres résultats publiés sur les trypanosomatidés, que cette régulation a lieu majoritairement au niveau post-transcriptionnel. Enfin, une recherche dans les banques de données des génomes des trois trypanosomatidés (T. brucei, T. cruzi et Leishmania major) des gènes impliqués dans l'autophagie (ATG) a été réalisée en parallèle et suggérait qu'au moins une partie de la machinerie était présente, même si ces voies de dégradation semblaient simplifiées par rapport à celles de la levure. Parmi les gènes identifiés se trouvaient les homologues à VPS34 et ATG7. Ces gènes ont été clonés et séquencés chez T. brucei. De plus, l'implication de TOR, PEX14 et PFK, protéines intervenant dans les étapes d'induction de l'autophagie chez la levure, a été étudiée grâce à l'utilisation d'inhibiteur spécifique ou de la technique d'interférence à l'ARN. Chacune de ces protéines semblait jouer un rôle dans les processus de dégradation chez les trypanosomes. Pour finir, la localisation de deux candidats ATGs a été analysée chez T. brucei: chez la levure, ATG7 et ATG8 s'associent avec des structures caractéristiques et différentes lors de l'activation de l'autophagie. La position d'ATG8 dans le trypanosome a été suivie à l'aide d'anticorps spécifiques et celle d'ATG7 grâce à la fluorescence de construction de fusion avec la GFP transfectée dans une ligne cellulaire monomorphe procyclique. Lors de la privation de nutriments, les protéines n'étaient pas colocalisées ; ATG8 se trouvait au niveau de structures ponctuées, ressemblant aux autophagosomes de levure, alors qu'ATG7 était dans le cytoplasme. En conclusion, nos expériences ont montré de façon préliminaire que les trypanosomes disposent de systèmes d'autophagie similaires à ceux de la levure. Les glycosomes de T. brucei sont dégradés de façon spécifique lors de la différenciation ou lors de la privation de nutriments. Cette dégradation est rapide et ceci est en accord avec l'hypothèse selon laquelle le système de compartimentation métabolique particulier impliquant les glycosomes pourrait avoir évolué conjointement au cycle de vie complexe du parasite, lui permettant de gérer rapidement les importants changements environnementaux qu'il subit. / The parasite responsible for sleeping sickness, Trypanosoma brucei, has a complex life cycle comprising various forms, each one being adapted morphologically and metabolically to the host environment, either in the mammal or the insect. During the differentiation stages, the relative importance of the glycolytic and the mitochondrial processes varies. The bloodstream form depends entirely on glycolysis for its ATP supply and its mitochondrial metabolism is almost fully repressed whereas for the procyclic trypanosome from the insect, glycolysis is less important. In trypanosomatids and all other protozoans of the order Kinetoplastida, most glycolytic enzymes are sequestered in specific organelles called glycosomes. Glycosomes and peroxisomes are similar organelles as judged from their morphology, their biogenesis and the presence of some common enzymatic systems. In various yeasts, like in trypanosomes, the peroxisomal metabolism and enzymatic composition varies, depending on the growth conditions. In these organisms, the biogenesis and degradation of the organelles occur in a selective and regulated manner. The population of peroxisomes is heterogeneous; old organelles, redundant or not anymore adapted to the environment, are degraded by pexophagy, a process similar to autophagy, whereas new peroxisomes, with a different metabolic repertoire, are synthesized. Consequently, this particular system of compartmentation increases the cell's metabolic flexibility and thus its ability to rapidly cope with environmental changes. The objective of the project presented in this thesis consisted in determining if the situation was similar for the trypanosome by studying the turnover of glycosomes and glycolytic enzymes in T. brucei during its differentiation. First, it was tested if degradation of glycosomes occurs when the parasites differentiate from one life-cycle stage into the next one, and this by studying the morphology using confocal and electron microscopy techniques. During the transition between the different bloodstream forms, a slight but significant increase of colocalisation between the glycosomes, immunologically labelled through the marker enzyme aldolase, and the lysosome, immuno-stained through its protein p67, was observed, indicative of an enhanced degradation of glycosomes. This tendency was even much more prominent when the bloodstream form transformed into the procyclic form. Moreover, it could be shown that in nutrient privation conditions, the parasites started to degrade the organelles as well. The glycosome degradation process as activated during the trypanosomes'...
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Citations
Herman, M. (2008). Analyse du rôle des glycosomes dans l’adaptation de Trypanosoma brucei aux changements environnementaux. https://hdl.handle.net/2078.5/112082