Post-translational regulation of deoxycytidine kinase activity : identification of Serine 74 as a crucial phosphorylation site for deoxycytidine kinase activity in leukemic cells
(2006)
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- Bontemps, Françoise
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- La désoxycytidine kinase (dCK) catalyse la phosphorylation de la désoxycytidine, de la désoxyadénosine et de la désoxyguanosine en utilisant l'ATP ou l'UTP comme donneur de phosphate. Cette réaction fait de la dCK une enzyme-clé de la voie de récupération des désoxyribonucléosides, qui fournit par une voie complémentaire à la synthèse de novo, les désoxynucléotides précurseurs de l'ADN. Grâce à sa large spécificité, la dCK permet également l'activation par phosphorylation d'une grande variété d'analogues de nucléosides utilisés en chimiothérapie anticancéreuse ou antivirale. Comme l'activité de la dCK joue un rôle primordial dans l'efficacité thérapeutique de ces médicaments, l'identification des mécanismes qui contrôlent l'activité de la dCK présente un intérêt tout particulier. L'objectif principal de cette thèse était d'élucider si l'activité de la dCK était contrôlée par phosphorylation dans les cellules leucémiques, un mécanisme de régulation qui avait déjà été proposé, mais non démontré de façon directe. Les résultats de cette étude ont fait l'objet de trois publications. .<BR> Le travail présenté dans le premier article avait pour but d'identifier la ou les voie(s) de transduction du signal potentiellement impliquée(s) dans la régulation post-traductionnelle de l'activité de la dCK. Dans ce but, nous avons utilisé toute une série d'inhibiteurs de protéines kinases et de protéines phosphatases dont nous avons analysé l'effet sur l'activité basale de la dCK ou sur son activation par la 2-chloro-2'-désoxyadénosine (CdA). Il avait en effet été proposé que cet analogue de nucléoside augmente l'activité de la dCK suite à une modification post-traductionnelle de l'enzyme. Cette étude ne nous a pas permis d'élucider la voie d'activation de la dCK par la CdA, mais nous a cependant montré que plusieurs inhibiteurs de protéines kinases modifiaient l'activité de la dCK dans divers types de cellules leucémiques, ce qui a consolidé l'hypothèse d'un mécanisme de régulation de l'activité de la dCK par phosphorylation/déphosphorylation. De plus, nous avons obtenu des données indiquant que l'activité de la dCK pourrait être contrôlée in vivo d'une part, par la voie de transduction du signal JAK/MAPK et d'autre part par la protéine phosphatase 2A qui pourrait agir directement sur la dCK. .<BR> L'objectif du travail décrit dans le second article était de démontrer que la dCK est une phosphoprotéine. Nous avons montré que la dCK, surexprimée dans les cellules eucaryotes HEK 293T, était marquée après incubation des cellules avec du [32P]orthophosphate. En outre, nous avons observé que le marquage de la dCK était moins important lorsque les cellules étaient incubées en présence de sorbitol connu pour diminuer l'activité de la dCK. Ces résultats nous indiquaient non seulement que la dCK pouvait exister sous forme d'une phosphoprotéine in vivo, mais aussi que son activité pouvait être corrélée avec son degré de phosphorylation. L'analyse à l'aide d'un spectromètre de masse des peptides de la dCK marquée au 32P nous a permis d'identifier quatre sites de phosphorylation: les Thr-3, Ser-11, Ser-15 et Ser-74, ce dernier site étant le plus abondamment phosphorylé. Des expériences de mutagenèse dirigée ainsi que l'utilisation d'un anticorps spécifique dirigé contre la Ser-74 phosphorylée nous a permis de démontrer que la phosphorylation de la Ser-74 était cruciale pour l'activité de la dCK surexprimée dans les cellules HEK 293T, alors que la phosphorylation des trois autres sites ne semblait pas être essentielle. L'anticorps dirigé contre la Ser-74 phosphorylée nous a également permis de voir que la Ser-74 de la dCK endogène de lymphocytes leucémiques était phosphorylée et que sa phosphorylation était augmentée par des agents qui augmentent l'activité de la dCK, comme la génistéine, un inhibiteur de proteines tyrosine kinases, ou les rayons UV-C. .<BR> Le troisième papier présenté dans cette thèse rapporte les effets d'une irradiation aux UV-C sur l'activité de la dCK dans des lymphocytes issus de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique de type B. Il était bien établi que l'irradiation aux UV-C crée des lésions dans l'ADN, entraînant une activation des mécanismes de sa réparation. Nous avons découvert que l'irradiation aux UV-C provoque aussi une augmentation de l'activité de la dCK qui joue un rôle prépondérant dans la synthèse des précurseurs de l'ADN dans les cellules quiescentes. Cette activation résulterait d'une modification post-traductionnelle de la dCK qui pourrait être initiée à la surface des cellules suite à un stress oxydatif. Des données supplémentaires nous ont indiqué que cette augmentation de l'activité de la dCK contribuerait à la réparation de l'ADN lésé suite à l'irradiation aux UV-C.<BR> En conclusion, par notre travail, nous avons démontré que l'activité de la dCK dépendait du taux de phosphorylation de la Ser-74 dans des lymphocytes leucémiques. Cette découverte pourrait être exploitée pour potentialiser l'activation des analogues de nucleosides utilisés en chimiothérapie antileucémique ou antivirale et dès lors leur efficacité clinique
- Affiliations
Citations
Smal, C. (2006). Post-translational regulation of deoxycytidine kinase activity : identification of Serine 74 as a crucial phosphorylation site for deoxycytidine kinase activity in leukemic cells. https://hdl.handle.net/2078.5/112148