Caractérisation génétique et fonctionnelle du locus blp impliqué dans la production de bactériocines chez Streptococcus thermophilus
(2007)
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- Les bactériocines des bactéries à Gram positif sont des peptides antimicrobiens capables d'inhiber la croissance d'espèces compétitrices en perturbant la perméabilité de leur membrane plasmique. La régulation de la production de bactériocines repose sur la sécrétion de molécules diffusibles appelées auto-inducteurs. A une concentration critique dans le milieu, qui dépend entre autre de la densité cellulaire (quorum sensing), ces auto-inducteurs induisent une cascade de signalisation menant, à terme, à l'induction des gènes nécessaires à la sécrétion de bactériocines dans l'ensemble des cellules bactériennes de la population. La production de bactériocines est un phénomène extrêmement peu étudié chez S. thermophilus. Pourtant, ces peptides jouent probablement un rôle clé dans l'évolution des interactions entre S. thermophilus et les autres bactéries lactiques utilisées couramment dans les processus de co-fermentation des produits laitiers. L'analyse du génome des souches industrielles LMG18311, CNRZ1066 et LMD-9 nous a permis d'identifier un locus potentiellement impliqué dans la production de bactériocines et régulé par auto-inducteur. L'originalité du système de régulation encodé au sein de ce locus réside dans son homologie avec le système BlpH/R des streptocoques pathogènes, impliqué dans la régulation de deux fonctions étroitement liées: la production de peptides antimicrobiens et la mise en route de la compétence pour la transformation génétique. Durant notre travail, nous avons testé l'hypothèse d'une implication du système StBlp dans la synthèse de bactérocines. L'utilisation de conditions artificielles d'induction du locus Stblp nous a permis de démontrer la fonctionnalité du système StBlp dans la souche LMD-9, ainsi que son rôle dans la production d'une bactériocine à large spectre d'inhibition, la thermophiline 9. Des techniques classiques de génétique ont ensuite été utilisées dans le but de déterminer le mode de régulation (quorum sensing?) et l'étendue des gènes induits par le système StBlpH/R. Les résultats obtenus ont montré que la production de la thermophiline 9 est étroitement liée à la croissance et à la densité cellulaire de S. thermophilus. Les délétions génétiques réalisées au sein du locus Stblp nous ont permis de proposer le schéma de régulation suivant. Le précurseur de l'auto-inducteur StBlpC est sécrété et maturé et, à une concentration critique, les formes matures du peptide induisent, par l'intermédaire de l'histidine kinase StBlpH et du régulateur transcriptionnel StBlpR, la transcription des gènes responsables de l'activité antimicrobienne et de l'immunité de la souche LMD-9. L'implication de ces gènes dans l'activité de la thermophiline 9 a ensuite été étudiée. Nous avons ainsi pu montrer que la thermophiline 9 est une bactériocine complexe dont le pouvoir antimicrobien dépend, d'une part, de l'association d'au moins trois peptides, et d'autre part, de l'activité d'une disulfure oxydase extracellulaire, StBlpG, spécifiquement impliquée dans l'activité anti-Listeria de S. thermophilus. Différentes hypothèses sur le mode d'action de la thermophiline 9 sont proposées. Enfin, le séquençage du locus Stblp et l'étude de sa fonctionnalité dans différentes souches industrielles de S. thermophilus nous ont permis d'émettre certaines hypothèses quant à son évolution et son rôle dans les interactions intra-et inter-espèces de S. thermophilus au sein de sa niche écologique. / Bacteriocins of Gram positive bacteria are antimicrobial peptides that inhibit growth of competing species by disturbing the integrity of the cell membrane. The regulation of bacteriocin production is based on the secretion of diffusible molecules called auto-inducers. At a critical concentration which reflects the cell density (quorum sensing), these molecules trigger a signalling cascade that leads to the production of bacteriocins in the whole population. The production of bacteriocins by S. thermophilus has been poorly studied, although these antimicrobial peptides likely play a key role in the evolution of interactions with other lactic acid bacteria commonly used in combination with S. thermophilus in dairy fermentations. Through analysis of the genomic sequence of the industrial S. thermophilus strains LMG18311, CNRZ1066 and LMD-9, we identified a locus displaying features of a quorum sensing-regulated bacteriocin production system. The regulatory system encoded within this locus is similar to BlpR/H from pathogen streptococci, which is involved in the regulation of two closely related functions: the production of antimcirobial peptides and the trigger of natural competence. In our study, we tested the involvement of the StBlp system in bacteriocin biosynthesis. Using artificial induction of the Stblp locus, we demonstrated the functionality of the StBlp system in LMD-9 and its role in the production of thermophilin 9, a broad inhibitory spectrum bacteriocin. Classical genetics was then used in order to elucidate the regulatory network of the StBlpR/H system (quorum sensing?) and determine its regulon. Our results demonstrate that the production of thermophilin 9 is closely coupled to growth and cell density. Based on the phenotype of deletion mutants, we propose the following regulatory scheme. First, the precursor of the auto-inducer StBlpC is secreted and matured. At a critical concentration, the mature forms of the peptide activate the histidine kinase StBlpH, which triggers the transcription of genes required for the antimicrobial activity and immunity of strain LMD-9, through the response regulator StBlpR. We also show that thermophilin 9 is a multi-component bacteriocin whose antimicrobial activity relies on the production of at least three peptides. In addition, an extracellular disulfide oxidase (StBlpG) appears to be specifically required for the inhibition of Listeria species by S. thermophilus. The possible mode of action of thermophilin 9 is discussed. Finally, the Stblp locus was sequenced from various industrial strains of S. thermophilus, and the functionality of the StBlp system was assayed. Based on these results, we discuss the possible evolution and ecological role of this bacteriocin production system in the intra- an inter-species interactions of S. thermophilus within its niche.
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Fontaine, L. (2007). Caractérisation génétique et fonctionnelle du locus blp impliqué dans la production de bactériocines chez Streptococcus thermophilus. https://hdl.handle.net/2078.5/124111