Effects of cryoprotectants and cryopreservation on in vitro produced bovine balstocysts
(2001)
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- Une cryopréservation réussie des embryons bovins produits in vitro est essentielle pour leur large diffusion. Cependant, les embryons produits in vitro sont très sensibles aux procédures de cryopréservation par rapport à ceux produits in vivo. Leur capacité de survivre à la cryopréservation et à la décongélation dépend largement de leur qualité et donc des conditions de culture in vitro. LA méthode de cryopréservation utilisée et les conditions de culture après décongélation sont autant de facteurs qui influencent aussi leur viabilité. En premier lieu, nous avons étudié l'effet des conditions de culture après vitrification et réchauffement sur la survie des blastocystes bovins produits in vitro. Après 72 h de co-culture, le taux de survie sur cellules BRL ou granulosa à 20% d'oxygène est plus élevé que celui obtenu avec 5% d'O2. Les cellules BRL à 20% d'oxygène garantissent une meilleure reproductibilité que les cellules granulosa à 5 ou 20% d'oxygène ou les cellules BRL à 5% d'oxygène. La fiabilité de la procédure de vitrification retenue pour réaliser nos futures expériences a été par la suite testée. Nous retenons l'effet dramatique de la forte concentration en éthylène glycol sur le taux de survie de l'embryon. En effet, les embryons vitrifiés avec une solution contenant 10% glycérol - 40% éthylène glycol ne survivent pas. Alors que ceux vitrifiés avec 25% éthylène glycol - 25% glycérol présentent un bon taux de survie et d'éclosion. Par ailleurs, aucun effet sur la survie n'a été observé en testant les deux modes de préparation des solutions de vitrification (base molaire ou molal) ou les deux modes de vitrification (vapeur d'azote liquide ou immersion directe dans l'azote liquide). La variation de la concentration en galactose pendant l'étape de dilution n'a pas non plus d'effet sur la survie après réchauffement. Néanmoins, le bon taux de survie obtenu in vitro avec cette méthode de vitrification n'est pas corrélé avec le taux de gestation après transfert. La simple exposition des embryons aux trois étapes de la procédure de vitrification, suffit à diminuer le taux d'éclosion et le nombre total de cellules. LA double coloration a révélé deux types de lésions cellulaires : 1) une perméabilisation des membranes cellulaires immédiatement après exposition aux cryoprotecteurs et dilution dans le galactose et l'ETF. Ces lésions sont réversibles après quelques heures de culture. 2) une incapacité de certains noyaux à fixer le bisbenzimide. Ces altérations semblent être causées par un choc osmotique induit pendant l'étape de dilution dans l'ETF. En effet, l'ajout d'une étape supplémentaire de dilution dans du galactose 0,42M avant l'étape de dilution dans l'ETF a permis de diminuer la proportion de cellules perméables à l'iodure de propidium et d'augmenter le taux d'éclosion après 72 h de co-culture. L'étude du comportement osmotique des blastocystes produits in vitro pendant les étapes d'équilibration et de dilution a permis d'établir une corrélation entre ce comportement osmotique et la survie in vitro. Un certain nombre de paramètres a été retenu pour sélectionner de manière prospective les embryons qui survivront et écloront après vitrification : le diamètre initial de l'embryon, les durées de contraction et de ré-expansion dans l'étape 10% glycérol, la durée de ré-expansion dans l'ETF, ainsi que le diamètre final dans l'ETF. Les plus gros blastocystes semblent mieux survivre que les plus petits aux étapes d'exposition aux cryoprotecteurs et de dilution. De plus, pour un âge donné, les plus gros blastocystes semblent avoir plus de chance de survivre et d'éclore après exposition aux cryoprotecteurs avec ou sans vitrification que les plus petits. La comparaison entre la congélation conventionnelle et la vitrification a permis de montrer que les taux de survie et d'éclosion obtenus avec ces deux méthodes sont similaires mais inférieurs à ceux des blastocystes non traités. Immédiatemnt après le traitement, la proportion de cellules montrant des altérations membranaires est similaire pour les deux méthodes. Cependant, les cellules ne pouvant fixer le bisbenzimide sont plus fréquentes dans les blastocystes vitrifiés. Le nombre total de cellules diminue après congélation ou vitrification, cependant cette diminution est plus marquée dans les embryons congelés et concerne spécialemen les cellules du trophectoderme. Par ailleurs, les blastocystes congelés consomment moins de glucose, de pyruvate et d'oxygène et ont activité glycolytique élevée, ce qui ne semble pas être la cas pour les vitrifiés. Quand le métabolisme est rapporté au nombre de cellules, aucune différence n'est notée entre les embryons congelés, vitrifiés ou contrôles. En conclusion, la vitrification permet d'obtenir de bon taux de survie et d'éclosion in vitro quand les conditions de culture après réchauffement sont adéquates. Cependant, ces taux sont plus faibles que ceux obtenus avec les embryons non traités. La majorité des lésions observées semble survenir pendant l'étape de dilution après l'exposition aux cryoprotecteurs ; ces lésions semblent induites par le choc osmotique après l'étape de dilution. Comparée à la méthode de congélation conventionnelle, la vitrification paraît altérer à un degré moindre la morphologie et le métabolisme embryonnaire ; puisque les embryons congelés présentent moins de cellules du trophectoderme et par conséquent, une utilisation plus faible des nutriments. Par ailleurs, les embryons congelés ont une activité glycolitique supérieure à celle des vitrifiés. Une corrélation positive a été établie entre la qualité des embryons avant vitrification et le développemnt in vitro après réchauffement, étant donné que les blastocystes de grande taille sont plus résistants à la vitrification que ceux de plus petite taille. En dépit d'un bon développement in vitro, les résultats des taux de gestation après transfert dans des vaches receveuses sont faibles. Ceci peut-être dû à des lésions non détectées dans notre étude et qui inhibent le développement embryonnaire in vivo. D'autres investigations sont nécessaires afin d'élucider la raison de ce faible développement des embryons vitrifiés après transfert.
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Citations
Kaidi, S. (2001). Effects of cryoprotectants and cryopreservation on in vitro produced bovine balstocysts. https://hdl.handle.net/2078.5/124220