La glucokinase hépatique : effet de différence sucres et polyols sur son activité et sa localisation intracellulaire
(1997)
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- Van Schaftingen, Emile
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- de cette localisation restant jusqu’à présent incertaine. En ce qui concerne la localisation subcellulaire de la glucokinase, plusieurs études récentes s’accordent à dire qu’au nouveau du foie de rat, dans des conditions physiologiques normales, la glucokinase est localisée sous une forme très peu active, dans le noyau, d’où divers métabolites parviennent à la libérer. La protéine régulatrice se trouve également dans le noyau, sa localisation n’étant dépendant influencée par aucun agent. <BR> Le chapitre II est consacré à la mise au point d’une nouvelle méthode de dosage du fructose-1-phosphate permettant de mesurer avec précision des concentrations de cet ester phosphorique 100 fois plus faibles que les méthodes précédemment utilisées. Son principe consiste à convertir le fructose-1-phosphate en fructose-2,6-bisphosphate, lequel peut être dosé à des concentrations picomolaires par sa propriété de stimuler l’activité de la PPi-PFK. La méthode comprend 7 étapes et inclut nécessairement l’élimination préalable de toute trace de fructose-2,6-bisphosphate (par traitement en milieu acide) et de fructose-1,6-bisphosphate (par la fructose-1,6-bisphosphatase). Sous l’action d’une phosphokinase spécifique, le fructose-1-phosphate est phosphorylé en fructose-1,6-bisphosphate, lequel est cyclisé par une carbodiimide en fructose-1,2-phosphate 6-phosphate. Par hydrolyse alcaline, l’intermédiaire cyclique est converti pour 15% en fructose-2,6-bisphosphate et pour 85% en fructose-1,6-biphosphate. La méthode permet aussi le dosage du fructose-1,6-bisphosphate, à conditions que les étapes d’hydrolyse en présence de la phosphatase et celle de phosphorylation soient supprimées. La spécificité de la méthode est très élevée, vu que la fructose-1-phosphate kinase est hautement spécifique du fructose-&-phosphate et que ka PPi-PFK est beaucoup plus sensible au fructose-2,6-bisphosphate qu’à n’importe quel autre ester phosphorique. La haute sensibilité de notre méthode nous a permis de montrer que le fructose-1-phosphate est normalement présent dans les hépatocytes en l’absence de tout apport de fructose exogène à une concentration proche de celle du fructose-6-phosphate, soit environ 25 µM. <BR> La chapitre III est consacré à l’étude du mécanisme par lequel différents agents, pour la plupart des sucres et des polyols, stimulent la translocation de la glucokinase dans des hépatocytes en culture. La sensibilité de la translocation au sorbitol et au fructose suggère la possibilité que ce phénomène soit lié à la formation de fructose-1-phosphate et implique donc la protéine régulatrice. Utilisant la méthode sensible de dosage du fructose-1-phosphate que nous avons mise au point, ainsi que le SDI 158, un puissant inhibiteur de la sorbitol déshydrogénase, nous avons pu montrer que l’effet stimulateur exercé par le sorbitol et le fructose sur la translocation de la glucokinase est effectivement parallèle à leur conversion en fructose-1-phosphate. L’effet plus important de faibles concentrations de sorbitol comparativement à celui du fructose s’explique par le fait que, dans des hépatocytes en culture, le polyol est utilisé plus rapidement que le cétose, vraisemblablement à cause d’un transport plus lent de ce dernier. En ce qui concerne l’effet positif des différentes préparations commerciales de mannitol sur l’activité et sur la translocation de la glucokinase, nous avons trouvé qu’il était dû à une contamination du mannitol par 1% de sorbitol. La présence de fructose-1-phosphate dans les hépatocytes en l’absence de fructose exogène ainsi que l’augmentation de sa concentration en présence de concentrations élevées de glucose s’explique par la formation endogène de fructose sous l’action de la glucose-6-phosphatase sur le fructose-6-phosphate. Les effets positifs du sorbitol, du fructose et des concentrations élevées de glucose, tant sur la translocation que sur la concentration de fructose-1-phosphate, sont partiellement inhibés par l’éthanol, le glycérol et la glucosamine. La mannoheptulose, cependant, stimule la translocation sans affecter la concentration de fructose-1-phosphate. Un étude cinétique de la glucokinase purifiée effectuée en présence de ce sucre montre que, contrairement à la N-acétylglucosamine, le mannheptulose se lie à la glucokinase compétitivement vis-à-vis de la protéine régulatrice. Ces résultats indiquent que la translocation est provoquée par des agents qui favorisent la dissociation du complexe glucokinase-protéine régulatrice soit par liaison à la protéine régulatrice (fructose-1-phosphate), soit à la glucokinase (glucose, mannoheptulose). La protéine régulatrice agirait donc comme une ancre nucléaire pour la glucokinase, l’empêchant ainsi d’être libérée pendant la perméabilisation des cellules par la digitonine. L’importance physiologique de cette localisation nucléaire des deux protéines n’a pas été élucidée. <BR> La chapitre IV est consacré à l’étude du mécanisme par lequel le mannitol et le sorbitol à des concentrations élevées (I0 ;5 environ 10 mM) inhibent la détritiation du glucose 2-tritié ainsi que la translocation de la glucokinase. A l’aide d’une mannitol-1-phosphate déshydrogénase spécifique, nous avons mesuré, dans des hépatocytes isolés incubés en présence de mannitol, une formation progressive de mannitol-1-phosphate, lequel est, tout comme le sorbitol-6-phosphate, un ligand de la protéine régulatrice qui renforce l’effet inhibiteur de celle-ci sur la glucokinase. Les concentrations µmolaires de mannitol-1-phosphate ainsi détectées sont suffisantes pour expliquer les effets négatifs exercés par le mannitol sur la glucokinase. Nous avons pu montrer que l’enzyme responsable de cette formation de mannitol-1-phosphate est la glucose-6-phosphatase. Celle-ci catalyse le transfert non spécifique du groupement phosphoryle de glucose-6-phosphate sur le mannitol et sur le sorbitol. <BR> La chapitre V reprend sous forme de conclusions générales le travail que nous avons réalisé et comporte une discussion brève sur la signification physiologique de la translocation comme elle a été suggérée par les différents chercheurs. <BR> le chapitre VI est consacré au matériel et aux méthodes que nous avons utilisés
- Affiliations
Citations
Niculescu, L. (1997). La glucokinase hépatique : effet de différence sucres et polyols sur son activité et sa localisation intracellulaire. https://hdl.handle.net/2078.5/111478