Etude de la fonction des substitutions D-alanine et glucose des acides téichoïques de Lactobacillus plantarum par une approche génétique
(2003)
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- Delcour, Jean
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- Cette dissertation est consacrée à l'étude fonctionnelle des substitutions D-alanine (D-Ala) et des groupements glycosyle portés par les acides téichoïques de Lactobacillus plantarum NCIMB8826, qui représentent avec le peptidoglycane, les 2 constituants majeurs de la paroi des bactéries Gram-positives (Gram+). Une approche génétique a été choisie, consistant en l'inactivation de gènes impliqués dans l'ajout de ces substitutions suivie de la caractérisation des mutants obtenus. En premier lieu, l'organisation de l'opéron dlt responsable de la D-alanylation a été décrite. Il contient en amont des gènes dltA, dltB, dltC et dltD déjà décrits dans d'autres espèces Gram+, 2 gènes inédits. Le premier gène de l'opéron, pbpX, code une protéine similaire à des PBP de faible poids moléculaire (LMW Penicillin Binding Proteins) de bactéries Gram+ et ayant une activité D,D-carboxypeptidase. La présence de pbpX au sein de l'opéron dlt de Lb. plantarum NCIMB8826 reste inexpliquée. En outre, nous avons pour la première fois révélé la présence en amont de dltA, du gène dltX codant une protéine de 49 acides aminés, probablement transmembranaire. Il s'avère que dltX est présent à cet endroit dans toutes les espèces où cet opéron a été identifié et que sa séquence protéique est fortement conservée. Ces données suggèrent que DltX participe au mécanisme de D-alanylation. Le défaut de D-alanylation du mutant dltB construit par la suite a été démontré par son incapacité à transférer de la D-[14C]Ala sur ses acides lipotéichoïques (LTA) et l'analyse de ces derniers en résonance magnétique nucléaire (RMN). Cependant, le déficit en D-Ala est partiellement compensé par l'ajout de glucose. L'analyse en spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS) révèle que la surface du mutant dltB contient 2 fois moins d'azote protoné, ce qui est en accord avec une perte des D-Ala. De plus, les observations en microélectrophorèse et la capacité accrue du mutant dltB à fixer des molécules cationiques (cytochrome c, nisine) convergent pour affirmer que la paroi est plus électronégative. L'inactivation de dltB entraîne un ralentissement de la croissance et une lyse en phase stationnaire. Au niveau morphologique, les cellules s'allongent et des perforations au niveau du septum ou du futur site de division apparaissent. La création d'un double mutant non seulement déficient pour dltB mais aussi pour l'autolysine potentielle Acm2, similaire à l'autolysine majeure AcmA de Lactococcus lactis, a permis de montrer qu'Acm2 intervient en phase stationnaire dans l'apparition des perforations et de la lyse et que les D-alanyl-LTA influencent l'activité d'Acm2. Par ailleurs, Acm2 exerce une fonction dans la séparation des cellules-filles. D'après la littérature, les LTA et les acides téichoïques de paroi (WTA) d'autres souches de Lb. plantarum portent aussi des substitutions glycosyle alors que l'analyse en RMN des LTA de Lb. plantarum NCIMB8826 n'en a pas détecté. Cependant, nous ne connaissons pas la composition des WTA de Lb. plantarum NCIMB8826 et les données de la littérature pour d'autres souches, indiquent un taux de substitution par des résidus glycosyle bien supérieur à celui des LTA. La glycosyltransférase TagE de Bacillus subtilis est la seule enzyme connue transférant des groupements glycosyle sur les WTA. Les inactivations individuelles de 3 protéines de Lb. plantarum NCIMB8826 possédant un domaine glycosyltransférase du même type que TagE ont donné naissance à 3 mutants tag. Les premières observations réalisées sur les mutants tagE1 et tagE4 indiquent que leur croissance et leur capacité à fixer le cytochrome c ne sont pas modifiées. Quant au gène tagF2, il code une protéine dont la région N-terminale est similaire à TagF qui permet l'allongement des WTA de B. subtilis et le domaine glycosyltransférase est C-terminal. La croissance du mutant tagF2 est plus affectée, sa capacité à fixer le cytochrome c et sa sensibilité à la nisine sont augmentées. Ceci pourrait s'expliquer si comme l'indique un premier résultat, les LTA sont totalement absents chez le mutant tagF2. TagF2 serait-elle, dès lors, impliquée dans la biosynthèse des LTA? This PhD thesis is dedicated to a genetic study of the functional role of D-alanine and glycosyl substitutions of teichoic acids in Lactobacillus plantarum, which represent with the peptidoglycan the main components of the cell wall of Gram-positive (Gram+) bacteria. A genetic approach consisting in knocking-out genes that catalyze the incorporation of these substitutions was chosen. First, the genetic organization of dlt operon responsible for D-alanylation was described. In addition to dltA, dltB, dltC and dltD genes already known in other Gram+ species, it comprises two unpublished genes located upstream of dltA. pbpX is the first gene of the operon and encodes a protein homologous to low molecular weight penicillin binding proteins (LMW PBP) with D,D-carboxypeptidase activity. Its presence in the dlt operon is unexplained. Moreover, we reveal for the first time the presence immediately upstream of dltA of a gene encoding a 49-amino-acid putative transmembranar protein that we called dltX. Interestingly, dltX is localized at this position in every species where the dlt operon was identified and its amino-acid content is highly conserved. These data suggest that DltX takes part in the D-alanylation machinery. The next step was the insertional inactivation of dltB, creating a mutant whose D-alanylation deficiency was demonstrated by the unability to transfer D-[14C]Ala on lipoteichoic acids (LTA) and nuclear magnetic resonance (NMR) analysis of LTA. Unexpectedly, the D-Ala lack is partially balanced by a glucose addition. The X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) analysis shows a two times decrease of protonated nitrogen surface content which is in agreement with the loss of D-Ala substituents. In addition, microelectrophoretic measurements and the enhanced ability to bind cationic compounds (cytochrome c, nisin) are leading towards a more electronegative cell wall. The dltB inactivation leads to a slower growth and a lysis in stationary phase. Morphologically, dltB cells become longer and perforations are appearing at the septum or at the next division site. The construction and characterization of a double mutant not only deficient for DltB but also for the Acm2 putative autolysin, homologous to Lactococcus lactis 's major autolysin AcmA, showed the involvement of Acm2 in the outbreak of perforations and lysis at stationary phase and that D-alanyl-LTA influence Acm2 activity. Furthermore, Acm2 is involved in cell separation as acm2 mutant is forming chains. According to the literature, LTA and wall teichoic acids (WTA) of other Lb. plantarum strains are also substituted with glycosyl residues while NMR analysis of Lb. plantarum NCIMB8826 LTA does not detect this kind of substitution. However, we do not know the composition of Lb. plantarum NCIMB8826 WTA and existing data about other strains report a glycosyl substitution level largely higher for WTA than for LTA. TagE from Bacillus subtilis is the only glycosyltransferase known that transfers glycosyl residues on WTA. Three tag mutants were created by individually inactivating three Tag proteins containing a glycosyltransferase domain of TagE type in Lb. plantarum NCIMB8826. First observations on both tagE1 and tagE4 mutants indicate that neither growth nor cytochrome c binding ability are modified. The third target gene tagF2 encodes a protein containing a N-terminal region similar to TagF dedicated to WTA elongation in B. subtilis and a C-terminal putative glycosyltransferase part. Growth is more affected in the tagF2 mutant. It binds more cytochrome c and is more sensitive to nisin than the control strain. This might be explained by a preliminary result indicating a complete absence of LTA in tagF2 mutant. Consequently, does this mean that TagF2 is involved in LTA biosynthesis?
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Citations
Palumbo, E. (2003). Etude de la fonction des substitutions D-alanine et glucose des acides téichoïques de Lactobacillus plantarum par une approche génétique. https://hdl.handle.net/2078.5/124199